Silenciamiento Genético mediante expresión de proteínas CRISPR–CAS9 en Bentamiana (Nicotiana benthamiana) como modelo de transformación genética.

El CRISPR-CAS9 se ha convertido rápidamente en una herramienta popular para la edición del genoma de plantas debido a su simplicidad, eficiencia, bajo costo y capacidad de edición múltiple. La proteína CAS y los ARN guía forman ribonucleoproteínas (RNPs) que reconocen un sitio de interés mediante la complementariedad del ARNg en la secuencia de ADN, lo que provoca cortes específicos
de la doble cadena del ADN. Estos cortes activan diferentes vías de reparación del ADN. Si hay fragmentos de ADN homólogos al sitio de interés disponibles, se puede producir una recombinación homóloga utilizando el mecanismo de reparación dirigido por homología celular (HR). En ausencia de ADN homólogo, se produce un proceso de reparación de unión de extremos no homólogos (NHEJ), que da como resultado pequeñas mutaciones de inserción o deleción conocidas como indels.
La edición del genoma tiene un potencial incomparable para el mejoramiento de cultivos, sin embargo, aún están basados en los métodos tradicionales de edición del genoma que pasan por la producción de una generación T0 genéticamente modificada, lo que conlleva a problemas de aceptación social.
El mayor desafío para la edición genética en plantas se encuentra en que las células vegetales están protegidas por paredes celulares robustas que complican la transformación. Por lo tanto, se propone en la presente propuesta, la inducción de la edición del genoma en células de Nicotiana benthamiana mediante el suministro de ribonucleoproteínas CAS9/ARNg mediante microinyección o biolística
utilizando el sistema de aceleración de liposomas cristalizados (CLAS), junto con la recuperación en ausencia de marcadores de selección como un enfoque para la edición del genoma en cultivos tropicales de interés.
La digestión parcial de las paredes celulares facilitará la inserción de proteínas sin dañar excesivamente la integridad celular, lo que conducirá a una recuperación y regeneración de tejidos más rápida. La incorporación de ribonucleoproteínas preensambladas en las células mediante microinyección puede dar lugar a eventos eficientes de edición del genoma. Además, como estrategia
alternativa, proponemos utilizar liposomas cristalizados en sistemas biobalísticos para administrar ribonucleoproteínas CRISPR. Los liposomas cristalizados podrían constituir una vía eficiente con una consistencia lo suficientemente estable para utilizarse como vehículos acarreadores en enfoques biobalísticos. Se ha demostrado que el uso de ribonucleoproteínas CRISPR induce la edición de
genes en ensayos in vivo sobre genes de interés como la Fitoeno Desaturasa (PDs). Por lo tanto, el uso de ribonucleoproteínas preensambladas para inducir la edición del gen de referencia NbPDs (gen para la Fitoeno Desaturasa en bentamiana) podría lograrse mediante microinyección o biolística utilizando un sistema de aceleración de liposomas cristalizados.

Establecer un sistema de silenciamiento genético mediante
expresión de proteínas CRISPR–CAS9 en Bentamiana (Nicotiana benthamiana) como
modelo de transformación genética.

1. Sistemas de producción alternativos sostenibles