Determinación de los mecanismos moleculares de proteínas pro-coagulantes humanas mediante cristalografía de rayos X de macromoléculas biológicas, -Fase II-.

Las enfermedades cardiovasculares, entre las que se encuentran los infartos cardíacos y los
accidentes cerebrovasculares, continúan siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en
países desarrollados y en vías de desarrollo (Wilkins et al., 2017), lo que se traduce en un fuerte
impacto económico en el sector salud, y Costa Rica no se exime de esta situación. En parte, lo
anterior se debe a que las bases estructurales y funcionales de los procesos de formación de los
coágulos sanguíneos o trombos se conocen sólo de forma incompleta y fragmentada. La trombina
juega un papel esencial en estos procesos, y los fundamentos atómico-moleculares de su
interacción con otros factores que participan en el proceso de coagulación son poco conocidas, en
particular su reconocimiento de importantes sustratos humanos como el cofactor VIII y el receptor
de plaquetas activados por proteasas (PAR1), los cuales son esenciales en los procesos
hemostáticos que participan en la formación del coágulo ante alguna señal de daño vascular. Por
otro lado, la cristalografía de rayos X es una técnica que permite resolver la estructura 3D de
complejos proteicos, pero requiere la cristalización previa de la muestra a analizar. Con el objetivo
de favorecer la formación de cristales del FVIII y de PAR1, respectivamente, acomplejados con la
trombina inhibida, dada la importancia de estas proteínas que modifican los procesos de
coagulación sanguínea, y continuando con los resultados obtenidos de proyectos anteriores dentro
de la hoja de ruta de esta línea de investigación, y con la colaboración del grupo de investigación
del Dr. Pablo Fuentes-Prior (Instituto de Investigación Biomédica del Hospital de Sant Pau,
Barcelona), se pretende determinar las interacciones atómico-moleculares entre mutantes
específicos del FVIII y del receptor PAR1 acomplejados con la trombina humana inhibida reversible
e irreversiblemente. Para ello (1) se generarán, sobreexpresión y purificarán mutantes dirigidos
sobre el factor VIII y el receptor PAR1, (2) se prepararán los complejos correspondientes entre los
mutantes dirigidos del FVIII y de PAR1, respectivamente con la trombina inhibida reversible ó
irreversiblemente, para buscar las condiciones de cristalización de estos complejos proteicos, (3)
los cristales obtenidos se llevarán a difractar con rayos X al sincrotrón ALBA en Barcelona
(España), para obtener la información cristalográfica, y (4) a partir de los datos colectados se
resolverán las estructuras 3D de los complejos proteicos preparados. Esta investigación se
entrelaza perfectamente, y es complementaria a la hoja de ruta de esta línea de investigación,
permitiendo avanzar hacia una mejor comprensión de los procesos de interacción entre la trombina
y estos factores proteicos; -y por lo tanto- de los mecanismos de formación de trombos.

Determinar las interacciones atómico-moleculares en los complejos FVIIITrombina-PPACK/Benzamidina y PAR1-Trombina-PPACK/Benzamidina mediante cristalografía
de macromoléculas.

Este proyecto de investigación se enmarca en el área de Aplicaciones Biomédicas, área definida como
prioritaria por la Escuela de Biología.